Robert Langdon, un symbologue américain, est entraîné malgré lui, lors d'un voyage à Paris, dans l'affaire du meurtre de Jacques Saunière, conservateur au Musée du Louvre. Langdon est soupçonné du meurtre, principalement à cause d’un message que Saunière a écrit sur le sol avant de mourir, s’achevant par la phrase « P.S. Trouver Robert Langdon ». Seule Sophie Neveu, cryptologue et petite-fille de Saunière, croit en l’innocence de l’Américain. Persuadée que le message de son grand-père s'adresse à elle en particulier, Neveu demande à Langdon de l'aider à en comprendre le sens (le message pouvant d'ailleurs leur permettre de comprendre qui est le vrai meurtrier). En retour, elle l'aide à échapper au commissaire Fache, lancé à ses trousses...
Langdon et Neveu découvrent par la suite que Saunière était à la tête du Prieuré de Sion, une ancienne et puissante confrérie, et qu'il a été assassiné par un membre de l'Opus Dei. L'assassin voulait protéger un secret dont le conservateur du Louvre avait connaissance, un secret susceptible d’ébranler les fondements de la foi chrétienne : Jésus de Nazareth aurait eu un enfant avec Marie Madeleine. Touché d’une balle dans le ventre, agonisant, Saunière a eu peur que le secret ne se perde après sa mort, et a donc cherché à le transmettre à sa petite-fille. Pour cela, il a écrit sur le sol un message abscons, espérant qu'elle seule pourrait le comprendre, à condition qu'elle soit aidée par le symbologiste Langdon, qu'il connaissait et en qui il avait confiance (d’où le « Trouver Robert Langdon », qui n’est nullement une accusation contre l'Américain). Il a également choisi de mourir dans une position symbolique rituelle, rappelant celle de l’Homme de Vitruve, de Léonard de Vinci, permettant ainsi à Langdon et à Neveu de comprendre que le secret a un rapport avec le peintre italien : en effet, celui-ci aurait été le chef du Prieuré de Sion et aurait cherché à exprimer à travers ses œuvres, de façon indirecte, ses idées sur la nature de la relation entre Jésus et Marie Madeleine.
Le thème central du Da Vinci Code est la lutte secrète entre les instances dirigeantes de l'Église catholique romaine et le Prieuré de Sion. L'objet de cette lutte est un secret connu des deux organisations, à savoir la paternité du Christ. La divulgation de ce secret menacerait le pouvoir de l'Église et risquerait d'ébranler les fondements de la civilisation occidentale. Soucieuse de conserver son pouvoir, l'Église semble donc chercher à détruire tout détenteur du fameux secret (dont le Prieuré), tandis que les membres du Prieuré luttent pour la préservation de ce même secret, qu'ils se transmettent de génération en génération. Sont par ailleurs évoquées en arrière-plan les deux idées selon lesquelles l'Église Catholique, voulant acquérir et garder le pouvoir, s'est interposée et imposée comme intermédiaire entre l'homme et Dieu, et l'union sexuelle, qui laisse toute la place à l'altérité homme - femme et qui est un moyen privilégié d'entrer en contact direct avec Dieu (voir la scène du Hieros Gamos, Union sacrée), est déclarée péché.
